Thérapie médiée par les ARNt pour les troubles liés au collagène VI dus à des mutations sans-sens

Valérie Allamand (Sorbonne Université, Inserm) et Yves Fromes (Myology Institute)

Environ 10% des maladies génétiques humaines sont dues à des mutations non-sens introduisant un codon stop prématuré (PTC), ce qui entraîne souvent une perte de fonction protéique. Le déficit en collagène VI (COLVI) cause des maladies neuromusculaires rares, cliniquement hétérogènes, pour lesquelles il n’existe pas de traitement à ce jour. Les patients portant des mutations non-sens dans les gènes codant le COLVI développent des symptômes précoces et sévères. Le projet vise à corriger les PTCs grâce à des ARN de transfert dont l’anti-codon est modifié, délivrés par vecteurs de thérapie génique, in vitro (cellules humaines et murines) et in vivo (modèle murin). Cette approche devrait permettre la ré-expression du COLVI et la restauration de l’homéostasie musculaire, ce qui sera validé par des approches de pointe complémentaires. Cette stratégie a le potentiel d’être bénéfique pour de nombreux patients atteints de maladies génétiques incurables.

Conception d’ARN régulateurs avec des modèles d’apprentissage automatique intégrés et évolution en laboratoire

Simona Cocco (Ecole Normale Supérieure (ENS), CNRS) et Bruno Sargueil (Université de Paris ,CNRS)

La conception de nouveaux ARN fonctionnels, avec une spécificité, une affinité, une stabilité thermique, une allostérie contrôlées, … est un défi fondamental en bio-ingénierie, avec de grandes promesses pour le diagnostic et les traitements thérapeutiques. Dans ce projet de doctorat, nous nous concentrerons sur deux classes d’ARN fonctionnels : les molécules bistables, qui changent de structure lors de la liaison de métabolites cognats, et les aptamères qui se lient à des cibles spécifiques. Nous développerons de nouvelles méthodes d’apprentissage automatique pour apprendre des modèles à partir de données de séquences collectées dans des bases de données publiques et d’expériences de sélection dirigée à haut débit (SELEX). Nous utiliserons ensuite ces méthodes d’apprentissage automatique pour concevoir des ARN fonctionnels, dont les propriétés structurelles seront validées à l’aide de méthodes de sondage chimique (SHAPE) et de ‘binding assays’, et pour guider les expériences SELEX. La thèse sera réalisée au sein du Laboratoire de Physique de l’ENS de PSL et du laboratoire Therapeutic Targets and Drug Design de Paris Cité, en collaboration avec le Laboratoire des Maladies Neurodégénératives du CEA-Paris Saclay.

Evaluation du flux calcique dans les cellules musculaires

Sonia Albini (Genethon)

La dérégulation du calcium dans la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) suggère que la dystrophine pourrait réguler les cascades de signalisation calcique telles que les entrées de calcium. La surcharge en calcium dans les myotubes DMD humains est associée à des lésions des fibres musculaires, ce qui indique que l’homéestase du calcium est essentielle à l’intégrité musculaire. Nous utilisons cet équipement pour surveiller les transitoires de calcium afin de détecter une régulation anormale du calcium dans la DMD afin de pouvoir l’utiliser comme lecture pour les tests de thérapie génique. Ainsi, la restauration du flux de calcium et, par conséquent, la stabilité de la membrane peuvent être évaluées à l’aide du système proposé

Utilisation d’organoïdes et d’organes sur puces pour résoudre des paradigmes de biologie fondamentale et de médecine régénératrice

Thierry Jaffredo (IBPS)

Les technologies d’organoïdes et d’organes sur puce prennent une importance croissante en biologie et en médecine régénératrice. L’unité de Biologie du Développement ainsi que d’autres équipes de l’Institut de Biologie Paris Seine prennent résolument ce tournant qui permet, au travers d’approches réductionnistes, de décomplexifier les questions biologiques tout en conservant des approches 3D du vivant. Nous souhaitons mutualiser et rationaliser ces approches en créant des conditions optimisées d’observation et de conservation des échantillons pour résoudre les questions biologiques et médicales que nous posons. Ces conditions comprennent l’acquisition d’un microscope de culture de type EVOS M500 spécialement dédié à l’observation fine et à la prise de vue de cultures de cellules 2D et 3D en lumière visible et en fluorescence ainsi qu’un congélateur à -150°C de 231 litres qui assurera la conservation stable et sûre des cellules pluripotentes, de leurs dérivés ainsi que des échantillons médicaux reçus par les équipes.

Plateforme automatisée de construction de librairies de pathogènes par conjugaison

Sara Napolitano and Angelica Frusteri (Institut Pasteur)

De nombreuses stratégies basées sur CRISPR ont été récemment développées pour comprendre le fonctionnement des bactéries. En microbiologie clinique, ces tests doivent être réalisés sur des collections d’isolats cliniques pour être pertinents. Mais, les souches pathogènes sont souvent difficiles à modifier génétiquement. La construction de collections de telles souches est un défi. Le but de notre projet est de développer une plateforme automatisée qui permette la construction robuste de ces collections grâce à l’usage de conjugaison bactérienne optimisée. La plateforme sera basée sur un robot pipeteur, un lecteur de plaque compact, un grand PSM et du logiciel pour le contrôle. Plusieurs applications seront réalisées, notamment pour disséquer l’origine de résistances aux traitements antibiotiques inattendues pour certaines souches. La plateforme construite sera partagée au sein de la communauté BioConvS sur demande raisonnable.

Microvésicules, une alternative aux thérapies cellulaires et géniques pour les lésions cécitantes de la surface occulaire

Benoit Souquet et Eric Gabison (Hôpital Fondation Adolphe de Rothschild)

Des cellules souches issues, par exemple, de cordons ombilicaux produisent des vésicules de tailles nanométrique qui ont de grandes propriétés thérapeutiques. Nous souhaitons apporter de nouvelles propriétés à ces cellules souches afin de diriger l’action thérapeutique des vésicules qu’elles produisent pour traiter des maladies de la cornée. La cornée est en quelque sorte le verre de montre de l’œil dont la fonction est de protéger l’intérieur de l’œil et d’être transparente. Certaines maladies de la cornée n’ont pas encore de traitement et vont progressivement opacifier la cornée et rendant ainsi les patients aveugles. Nous souhaitons fabriquer un médicament sous forme de collyre contenant ces vésicules modifiées pour traiter ces maladies. Mais pour manipuler et observer ces vésicules invisible à l’œil nu et difficilement observable avec des microscopes classiques, des instruments spéciaux sont nécessaires.

Produire des anticorps monoclonaux recombinants sans produits d’origine animale

David Tareste (Institut de Psychiatrie et Neurosciences de Paris (IPNP))

Les anticorps monoclonaux jouent un rôle crucial dans diverses applications scientifiques et médicales, de la détection de molécules au développement de traitements contre le cancer ou les maladies infectieuses. Les méthodes actuelles de production d’anticorps impliquent l’injection d’antigènes dans des animaux – induisant stress et douleur – et nécessitent leur sacrifice pour la purification des anticorps. Notre projet propose de s’affranchir de l’utilisation de produits d’origine animale dans la production d’anticorps. Nous tirerons parti des séquences d’anticorps disponibles, qui seront clonées dans des lignées cellulaires permettant d’obtenir un fort taux d’expression protéique sans utiliser de composants d’origine animale. Ces anticorps monoclonaux recombinants seront purifiés en utilisant le système AKTA demandé et analysés qualitativement à l’aide de systèmes déjà disponibles sur notre plateforme. Cette approche offre non seulement un moyen de production plus éthique, mais améliore également la qualité et la spécificité des anticorps monoclonaux en évitant les produits d’origine animale qui peuvent affecter la reproductibilité.

Approche multidisciplinaire pour stimuler la bioproduction et l’ingénierie de vésicules extracellulaires (EVs) chez les bactéries à Gram+ à visée thérapeutique anti-inflammatoire.

Jean-Marc Chatel (MICALIS)

Nous proposons une biothérapie basée sur des vésicules extracellulaires thérapeutiques (EVs) comme alternative aux probiotiques vivants. Les EVs seront produites dans un bioréacteur évolutif à haut rendement à partir de bactéries Gram+ abondantes dans le microbiote intestinal et caractérisées aux niveaux biophysique et moléculaire (protéines, lipides, sucres, acides nucléiques, métabolites). Nous allons également modifier le contenu des EVs afin d’améliorer leur activité immunomodulatrice intrinsèque. Les propriétés anti-inflammatoires et neuromodulatrices des VE d’une espèce isolée et d’un pool de VE d’une combinaison d’espèces seront testées in vitro et in vivo dans des modèles précliniques d’inflammation aiguë (maladies inflammatoires de l’intestin-IBD), d’inflammation à bas bruit (syndrome de l’intestin irritable-IBS) associée à des troubles cognitifs, émotionnels et comportementaux, et de pathologie neurodégénérative (maladie d’Alzheimer).

Brassage Rationnel : Optimisation des AAV pour une Thérapie Hépatique Ciblée

Tiziana La Bella (Genethon)

Les virus adéno-associés (AAV) sont les vecteurs privilégiés pour la thérapie génique in vivo en raison de leur excellent profil de sécurité et de leur efficacité prouvée dans des études précliniques et cliniques, ayant abouti à l’obtention d’une autorisation de mise sur le marché pour certains produits à base d’AAV. Malgré ces énormes succès, des limitations dans leur utilisation persistent, notamment en ce qui concerne la spécificité du ciblage tissulaire et la réponse immunitaire contre la capside de l’AAV chez l’homme. Ce projet vise à développer une nouvelle génération de vecteurs AAV pour la thérapie génique du foie en utilisant une méthode d’ingénierie innovante. Nos approches impliquent des modifications de la surface de la capside de l’AAV, qui joue un rôle central à la fois dans le tropisme tissulaire et la reconnaissance par les anticorps. Le projet vise à identifier les régions de la capside cruciales pour le tropisme hépatique afin de développer des variantes d’AAV améliorées.

Phenotypage de nouvelles thérapies géniques optimisées du Syndrome de Rett

Nicolas Panayotis (SPPIN – Saints-Pères Paris Insitute for the Neurosciences)

« Le syndrome de Rett (RTT) est un trouble du neurodéveloppement causé par des mutations du
régulateur transcriptionnel MeCP2. Le RTT est incurable mais la réexpression de MeCP2 chez la
souris adulte permet de stopper la pathologie. La thérapie génique se heurte à la difficulté de contrôler
les niveaux de MeCP2. MeCP2 est nucléaire, mais les mécanismes impliqués dans son transport,
dont la machinerie des importines, n’ont jamais été ciblés dans le RTT. Nous développons ici une
thérapie moléculaire combinant la réexpression de MeCP2 et la manipulation des importines. La
mutation T158M perturbe la liaison de MeCP2 à l’ADN et cause un RTT sévère. L’acquisition
d’Ethovision XT permettra d’analyser le comportement de souris T158M traitées avec différents
vecteurs afin de définir leur impact therapeutique in vivo. Cette recherche s’accompagnera d’analyses
moléculaires et permettra de comprendre comment améliorer des pathologies résultant de l’altération
des niveaux subcellulaires de facteurs de transcription. »

Criblage haut contenu pour neurones sur puces myélinisés

Hugo Salmon (Université Paris Cité – Faculté de Sciences)

Les neuropathies périphériques touchent 5% de la population générale après l’âge de 50 ans et sont causées par un large éventail de facteurs parmi lesquels le diabète, les causes génétiques, les toxiques (tels que les chimiothérapies, les polluants) et les habitudes de vie. Les vésicules extracellulaires (VE) semblent jouer un rôle important dans la régulation de la physiologie de la myéline. Elles constituent une voie potentielle pour les biothérapies basées sur les VE, en particulier pour les neuropathies périphériques démyélinisantes. Dans HCS-MOCHI, nous développerons le criblage à haut contenu (HCS) pour explorer un modèle neurofluidique myélinisant. En tirant parti des architectures compartimentées et de la microfluidique en thermoplastique, le HCS permettra un meilleur contrôle de la différenciation des neurones et des CS, depuis l’état précurseur jusqu’à la myélinisation, compatible avec le criblage à haut contenu pour la neuropharmacologie.

Nouvelles méthodes de bioproduction de Vésicules Extracellulaires pour le traitement des patients traumatisés

Marina Trouillas (Hopital Paul-Brousse – Insitut André Lwoff)

Les traumatismes graves constituent la principale cause de décès chez les jeunes dans le monde. Les traumatismes, toutes causes confondues, induisent une dérégulation des grands carrefours physiologiques qui contribuent à court terme à la destruction cellulaire et tissulaire et à des anomalies de la réparation. Notre unité a déjà démontré que les cellules stromales mésenchymateuses ainsi que leurs facteurs de sécrétions sont capables de moduler ces voies, et ainsi, limiter l’aggravation des lésions ou favoriser la réparation tissulaire. Dans une démarche de recherche translationnelle, nous sommes confrontés aux contraintes réglementaires de production de qualité clinique. L’acquisition d’un bioréacteur contribuera à développer nos moyens de production de produits acellulaires optimisés pour la réparation tissulaire, préparés dans des conditions compatibles avec les exigences réglementaires.

Approches de thérapeutie génique pour les maladies neuromusculaires rares

Project leader: Valérie Allamand

Equipment: electroporation system Neon NxTTM (InVitrogen)

Les maladies neuromusculaires regroupent de nombreux phénotypes, hétérogènes cliniquement et génétiquement, dont un grand nombre ne dispose pas de traitement. Nos projets ont pour but de comprendre les mécanismes pathologiques en jeu afin de proposer des approches thérapeutiques innovantes, testées en premier lieu dans des modèles cellulaires dérivés de patients (cutanés, myogéniques, neuronaux, iPSCs) avant de passer à des études précliniques sur modèles animaux. Le projet proposé repose sur des approches de thérapie génique visant à ré-exprimer ou moduler l’expression de protéines mutantes, par ARNt, sur-expression et/ou ARN interférence. Ces approches sont limitées en raison de la difficulté à transfecter les cellules primaires/immortalisées humaines et de souris. L’acquisition du système d’électroporation Neon™ NxT permettra de lever ce verrou technologique et d’améliorer nos approches de thérapies géniques in vitro.

BIOTHÉRAPIES D’AVENIR POUR LES BRÛLES GRAVES

Project leader: Sébastien Banzet

Equipment: Nanoparticle characterization device VIDEODROP (Myriade)

La thérapie cellulaire a montré son intérêt dans plusieurs indications de réparation tissulaire, notamment la cicatrisation. Les brûlures graves sont d’origine thermique, ou radiologiques. Elles ne peuvent pas cicatriser seules et relèvent alors d’une greffe de peau, consistant à prélever chez le patient de la peau saine et la lui greffer sur la zone brûlée. Il faut réaliser une expansion importante du greffon pour couvrir des grandes surfaces, ce qui pose des problèmes de prise de greffe. Notre groupe a mis au point un traitement adjuvant à la chirurgie, consistant à prélever des cellules du patient, les multiplier et les injecter au moment de la greffe. Cette méthode améliore la prise de greffe et diminue l’inflammation. Nous travaillons sur une approche plus simple visant à traiter non pas avec les cellules, mais avec des substances qu’elles sécrètent dont des vésicules extracellulaires (VE). Ces produits seraient plus faciles à conserver et immédiatement disponibles. L’acquisition du matériel sollicité permettrait de quantifier ces VE à tous les stades de production.

Identification et isolation de bactéries commensales bénéfiques associées à la muqueuse

Project leader: Benoit Chassaing

Equipment: SH Cell Sorter (SONY)

Le tractus intestinal est colonisé par une myriade de micro-organismes, appelée microbiote
intestinal, qui comprend à la fois des membres bénéfiques et délétères. Par exemple, dans la couche de
mucus pratiquement stérile qui protège l’épithélium intestinal, l’équilibre entre les membres bénéfiques
et délétères du microbiote est étroitement associé à l’état de santé de l’hôte. L’objectif de ce projet est
d’isoler, de biobanquer et de caractériser de nouvelles bactéries bénéfiques résidant dans le mucus. Pour
cela, nous proposons de constituer une biobanque de commensaux isolés de la muqueuse à l’aide d’un
équipement capable de trier des bactéries isolées à partir de biopsies de muqueuses, provenant de nos
modèle souris ou de nos essais cliniques en cours. Suite à un marquage, les bactéries sont triées et placées
dans un environnement exempt d’oxygène afin de maintenir leur viabilité. De telles bactéries vivantes
associées au mucus ne peuvent pas être isolées avec les équipements actuellement disponibles et
contribueront grandement à la compréhension du rôle joué par ces colonisateurs du mucus en santé
humaine. De plus, ce projet permettra d’étendre considérablement la gamme de candidats dérivés du
microbiote ayant des propriétés bénéfiques (probiotiques de nouvelle génération).

Identification des fractions actives de produits sanguins sur la cicatrisation cornéenne

Project leader: Eric Gabison

Equipment: KR2I TFF System- KF COMM 2- with scale (REPLIGEN)

La cornée est la lentille protectrice de l’oeil, parfaitement transparente. La couche la plus superficielle de la cornée est en perpétuel renouvellement, permettant de conserver la transparence et de faire face aux agressions du quotidien. Dans le cas de pathologies, d’infections ou de traumatismes la cicatrisation peut induire une opacification cornéenne conduisant à une baisse de l’acuité visuelle, voir à la cécité. Il existe des médicaments sous forme de collyre, préparés à parti du sang du patient, favorisant la guérison en préservant la transparence. Notre projet est d’identifier les molécules actives afin de développer des collyres plus efficaces pour des pathologies cornéennes pour lesquelles les thérapies ne sont pas satisfaisantes ou très chères. Nous souhaitons isoler une fraction particulière du sang pour valider nos hypothèses et pour cela nous avons besoin d’un système de filtration tangentielle qui soit utilisable en routine dans notre laboratoire.

DACS

Project leader: Jacques Fattaccioli

Equipment: MOTIC Inverted Epifluorescence Microscope

Les thérapies cellulaires ont récemment révolutionné le traitement des cancers circulants et offrent d’immenses promesses pour les cancers solides. Cependant, leurs coûts de fabrication prohibitifs restent un obstacle majeur à leur démocratisation. Il est donc crucial de développer des outils qui automatisent, standardisent et garantissent la flexibilité et la mise à l’échelle. Parmi les étapes de fabrication, les manque de contrôle des solutions actuelles de tri/activation limitent la standardisation et mise à l’échelle de leur fabrication. À l’École Normale Supérieure, nous visons à développer un système automatisé fermé basé sur notre technologie brevetée (DACS) pour relever ces défis. Le DACS permet un tri et une activation cellulaires à haute sélectivité sans limites de volume ni de concentration cellulaire tout en préservant leur viabilité.

Imagerie et analyse à haut débit pour évaluer l’architecture endothéliale vasculaire après stimulation

Project leader: Diego Garcia-Weber

Equipment: filters and lenses for Cytation5 (Agilent)

Le microbiote intestinal sain produit plusieurs familles de petits métabolites anti-inflammatoires qui atteignent la circulation systémique et finissent donc en contact direct avec l’endothélium vasculaire. Bien qu’il ait été montré que certains d’entre eux exercent des effets protecteurs sur les cellules endothéliales, l’effet de la grande majorité d’entre eux n’a pas encore été étudié dans des modèles endothéliaux, principalement en raison de la difficulté d’accéder à des technologies d’imagerie à haut débit. Ce projet vise donc à mettre en oeuvre une technologie d’imagerie et d’analyse à haut débit pour cribler l’effet des métabolites bactériens sur l’architecture des cellules endothéliales. Grâce au présent appel à projets, le microscope automatisé Cytation5 d’Agilent déjà présent dans le laboratoire sera amélioré avec des objectifs plus résolutifs (20x, 40x), plus de longueurs d’onde d’excitation (GFP, RFP, Cy5) et une version complète du logiciel d’analyse (Gen5iPrime). Il sera mis à la disposition des autres membres du laboratoire, de l’institut CRSA et du réseau de collaborateurs actuels et futurs de l’équipe.

Biomatériaux délivrant du glucose pour promouvoir la survie des CSM

Project leader: Hervé Petite

Equipment: SPARK Multi-Mode Microplate Reader (TECAN)

Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des candidats prometteurs pour la médecine régénérative, mais la « preuve de concept » initiale de la plupart des thérapies basées sur les CSM n’a pas encore été traduite en pratique clinique de routine en raison de leur mort massive après l’implantation. Le B3OAa démontré pour la première fois que les CSM exposées à une quasi absence d’oxygène mais pas à une privation de glucose, restaient viables et fonctionnelles. Ces observations démontrent en fait que les CSM chargées dans des biomatériaux supplémentés en glucose sont capables de survivre à un épisode ischémique et rester fonctionnelles, nous incitant à développer des biomatériaux libérant du glucose. La preuve de concept de tels biomatériaux libérant du glucose a été établie à B3OA. Le projet proposé vise à optimiser davantage ces matériaux et à évaluer leur fonctionnalité dans le contexte de la réparation osseuse. A terme, ces matériaux auront de nombreuses autres applications en médecine régénératrice à médiation cellulaire.

Médecine de précision pour les patients atteints de mucoviscidose

Project leader: Isabelle Sermet-Gaudelus

Equipment: MTECC setup

La mucoviscidose est une maladie génétique mortelle qui touche environ 70 000 personnes dans le monde. La protéine CFTR est le principal canal chlorure de l’épithélium des voies respiratoires. L’absence ou le dysfonctionnement de CFTR entraîne l’accumulation de mucus épais dans les voies respiratoires, une infection et une inflammation chroniques et enfin une insuffisance respiratoire. Les modulateurs de CFTR qui traitent la cause sous-jacente de la maladie en corrigeant directement la protéine CFTR, conduisent à une amélioration considérable de la fonction respiratoire et de la qualité de vie pour 85% des patients.Pour les 15 % restants, nous avons démontré que la restauration de l’activité de CFTR dans les cultures primaires nasales, imitant une muqueuse respiratoire reconstituée, peut être utilisée pour prédire la réponse aux modulateurs de CFTR actuels (médecine personnalisée) et pour rechercher de nouvelles stratégies thérapeutiques (médecine de précision). Cela ouvre la voie à l’utilisation de la restauration de l’activité CFTR comme biomarqueur prédictif de la réponse respiratoire clinique chez les patients atteints de mucoviscidose traités par des stratégies visant à restaurer CFTR. Ce financement soutiendra l’achat d’un appareil qui accélérera considérablement notre programme de recherche, en permettant de réaliser de nombreuses expériences simultanées de manière automatisée, pour évaluer l’activité de CFTR.